做转录组测序前需要知道的那些事
做转录组测序前需要知道的那些事
转载2016-05-31 10:57:52
1.转录组的研究对象
转录组包括特定细胞或组织在某一时期内表达的所有RNA的集合,包括各种small RNA,lncRNA(long non-coding RNA)及mRNA等,因此做转录组测序理论上可以研究各种长度范围的RNA序列。针对转录组的测序,通常称为transcriptome sequencing,或简称为RNA-seq。
RNA-seq的研究对象,特定细胞的所有RNA,表格来自NATURE REVIEWS MICROBIOLOGY,(AJ Westermann et al.,2012)
2.转录组的建库和测序策略
根据不同的研究对象,需要选择相应的建库策略。
(1)如果研究的是mRNA,则可以通过富集polyA的方式来调取mRNA,进行建库测序;
(2)如果研究的是lncRNA或者lncRNA+mRNA,则可以通过去rRNA试剂盒的方式,去除rRNA后进行建库测序;
(3)如果研究对象是small RNA,则采用sRNA的建库策略,对18-40nt范围的sRNA进行切胶富集后建库测序。
根据不同的研究目的,又可以选择不同的测序策略。
(1)如果仅仅想了解不同样品间基因或sRNA的表达差异,则选择SE(single end)测序即可,测序量10M reads以上;
(2)如果需要进行基因的可变剪切、挖掘新基因、对现有基因的注释进行优化、检测基因融合等结构方面的分析,则建议选择PE(pair end)测序,测序量根据物种基因集合的大小,一般要至少2G以上的clean data。
3.基于转录组测序的主流研究手段
(1)RNA-seq denovo,基于序列组装,用于从头构建某物种的转录本序列;
(2)RNA-seq quantification,用于对已有参考基因序列的物种进行基因的定量;
(3)RNA-seq resequencing,对于已有参考基因的物种,进行基因定量、基因可变剪切、基因融合、新基因检测等分析;
(4)lncRNA-sequencing,主要研究lncRNA的表达量,预测新的lncRNA及其功能。
(5)sRNA sequencing,主要研究和分析small RNA序列,特别是miRNA的表达情况,并预测novel miRNA,miRNA靶基因分析等。
4.转录组测序的优势及应用
优势:
(1)相对于芯片技术,转录组测序能够检测新基因和新的变异,且检测覆盖面更广,且准确性更高;
(2)相对于传统的一代测序技术,基于二代测序技术(NGS)的转录组测序则通量更大,覆盖面广,单碱基成本更低。
RNA-seq相对于其他技术的优势,表格来自NATURE REVIEWS GENETICS,(Zhong Wang et al.,2009)
应用:
(1)在动植物研究领域,可以通过转录组测序来从头构建某一物种的参考基因集,或者通过转录组测序的数据对已有的基因集进行补充和优化;
(2)在医学研究领域,可以通过转录组测序来找出疾病与正常组织差异表达的基因,或者寻找疾病组织特异表达的基因或转录本(融合基因、新转录本等),用于寻找疾病特异的biomarker。