体外应用Cas9系统实现对上百kb的基因组片段的靶向克隆
2015年的时候看到这样篇论文，了解到Cas9可以进行体外酶切。
清华大学生命科学学院朱听研究员课题组在《自然-通讯》上在线发表了题为《CATCH技术实现大型基因簇一步法靶向克隆》（Cas9-Assisted Targeting of Chromosome segments CATCH enables one-step targeted cloning of large gene clusters）的论文，首次体外应用Cas9系统实现对上百kb的基因组片段的靶向克隆。
分子克隆技术已被广泛应用于现代生物学的各个领域，但传统的PCR（聚合酶链式反应）技术通常很难一步得到15 kb以上的片段，传统的限制性核酸内切酶识别位点仅6-8个碱基，对生物基因组不能有效实现特异性，因此对于较长目标片段的克隆或合成始终存在阳性率低，步骤复杂，成本高等问题。近年来人们在细菌中发现的CRISPR系统可以实现对外源序列的特异性识别和有效切割，在此基础上，科学家们开发出许多基因编辑、基因表达调控，体内成像等工具。然而对该系统的体外应用则鲜有报道。朱听课题组利用体外转录制备的sgRNA和表达纯化的Cas9蛋白特异性酶切目标全基因组，并通过同源序列互补将长达100 kb的目标片段一步连接到细菌人工染色体上实现特异性克隆。通过脉冲场电泳可以清晰观察到目标大片段从全基因上的有效分离，其克隆效率可与普通短片段克隆相当。
https://www.nature.com/articles/ncomms9101.pdf
还有另外几篇关于cas9体外酶切的
1、In Vitro CRISPR/Cas9 System for Efficient Targeted DNA Editing
2、基于基因组编辑技术的大片段克隆新策略
3、The CCTL (Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA ligase-assisted Ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro
第三篇的新闻报道
国际学术期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）在线发表了中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所赵国屏研究组题为The CCTL (Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA ligase-assisted Ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro 的研究论文。该工作鉴定了Cpf1蛋白的精确切割位点，并基于该切割特性开发新的DNA无缝拼接方法。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是存在于原核生物中的获得性免疫系统，CRISPR相关蛋白Cas9已广泛应用于基因组编辑和许多其他应用当中。Cpf1蛋白隶属于II类type V CRISPR系统。相比于Cas9蛋白，Cpf1蛋白具有类似的基因组编辑效率，但具有较低的脱靶效应，在基因治疗应用中具有巨大的潜力。不同于Cas9，Cpf1由单个crRNA指导，并利用富含T的protospacer相邻基序（PAM）序列切割双链DNA（dsDNA）靶标，形成5-nt粘性末端。Cpf1的切割特性使得其成为有效的体外DNA拼接工具，并且最近的研究中报道了基于Cpf1消化和T4DNA连接酶介导的连接建立的DNA拼接标准C-Brick。
在该研究中，研究人员发现，Cpf1切割靶标DNA并不像之前报道的那样，只切割靶标DNA互补链的23位和非互补链的18位，而是在非互补链的14位到18位形成多个切割位点。除此之外，该文研究人员还发现Cpf1的切割位点受到crRNA spacer序列长度的影响。当spacer序列长度大于等于20的时候，Cpf1倾向于切割非互补链的18位，而当spacer序列长度小于20的时候，Cpf1倾向于切割非互补链的14位。基于Cpf1在较短spacer长度的crRNA介导下，可以特异切割靶标DNA的14位与22位，形成8－nt的长黏性末端的特性，结合Taq DNA连接酶高精度的连接特性，研究人员将其开发为一个大DNA片段体外无缝编辑的新工具。在应用实例中，研究人员成功将30kb的放线紫红素合成基因簇内部调控基因actII-orf4 的启动子进行了原位的替换。经过反应条件的优化，替换的阳性率达到70%以上。该方法为大片段体外编辑提供了一个高效工具。
现在有生物公司提供cas9体外酶切试剂盒，有兴趣的朋友可以自行搜索，貌似还挺便宜，这里就推荐了。具体的技术方面问题我也没啥经验，我也是只知道体外酶切可行，上述的文章都是我们中国人发的，大家可以联系相关课题组了解情况。