空间转录组第三讲：图像手动对齐
前面介绍Space Ranger的使用的时候有提到过，一种是自动对齐（只需要提供图片文件），另外一种是手动对齐（除了需要提供图片文件，还需要提供图像组织位置跟spot对应信息的json文件）。今天来介绍一下10x空间转录组Visium 的图像手动对齐。
Space Ranger管线使用 自动图像检测算法 来计算基准标记的位置，并找到组织的边界。10x Genomics在各种各样的H＆E图像，组织和样本上测试了该算法，并发现检测算法是可靠的。但是，对于免疫荧光图像，或在基准标记物模糊或组织边界不清楚的情况下，将需要手动进行基准对准和组织概述。
其实除了图像模糊边界不清楚之外还有一些情况需要考虑手动调整图像，比如说有少量组织碎片掉在了载玻片其他位置上，不去除的话图像上某个角落里出现一个或几个孤零零的点太影响美观，另外比如说组织上有脏的地方，或者某块区域有粘膜挡住了也可以通过手动的方式把这些地方去除掉。
使用Loupe Browser（需4.0以上版本）来进行手动对齐
如果没有安装Loupe Browser需要先安装一下
下载地址跟Space Ranger是同一个，直接点击下载就好了
https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest
第一步：打开Loupe Browser
Visium手动对齐向导在Loupe Browser开始页面的左下方，找到Align a Visium Image。
第二步：点击Align a Visium Image
单击链接将启动向导。向导的第一页显示了Visium载玻片的示意图，包括幻灯片上***的位置以及载玻片上每个捕获区域的位置。
第三步：导入图片
点击Input Alignment Data，进入图片导入界面。
点击Open Image导入图片，可以提供TIFF或者JPEG图像文件，如果提供的TIFF图像特别大的话有可能花的时间会比较久甚至直接导不进去，建议最好使用JPEG图像文件。
10x官网提供了一个示例文件，大家如果还没有自己的图像文件可以拿这个文件先试试。
• 图片： 下载
• slide***：V19L29-035
• 捕获区域：A1
选择载玻片slide***和捕获区域
输入载玻片信息有三个选项：
- 默认直接输入载玻片***和图像的捕获区域。此选项需要联网，因为需要从10x官网下载最新的slide信息文件。
- 已经下好了slide文件，比如V19L29-035.gpr，点击第二个选项是会提示选择对应的slide文件。第二个选项更适合脱机模式。
- 最后，如果图像的***和捕获区域未知或不可用，仍然可以使用第三个选项进行手动对齐。Visium手动对齐向导会使用理想化的网格布局来代替对齐步骤，而不是特定于载玻片的slide点偏移文件。从理想栅格到实际滑动位置的每个点的增量可能在5到15微米之间，大大小于每个点的宽度。斑点精度有些损失，但是斑点与基础图像之间的关系仍然是连贯的。
第四步：将spot点与图像对齐
这一步主要是标记四个角，依次用鼠标点击上面四个形状的最中心，注意顺序不要错，每次软件左边会有提示标记哪个形状。
四个角标记好之后会出现上述红色边框，看一下红色边框跟灰色圆点的位置对应关系，不要有比较大的偏移就好，一般不可能完全重叠起来，多少回有点偏移。如果觉得偏移太大，可以点击Clear Centers清除原来的标记，重新再标记一次。
第五步：选取组织
上一步完成后点击Continue进入选取组织步骤。
这里主要有下面一些工具：放大、缩小、移动、套索、babel标记、橡皮擦等。
大部分情况我们只用套索工具就好了，用套索选择要标记的区域然后标记为组织或是背景。
如果实在是想把整块组织里某块很小的区域标记为背景，用套索不太好操作，可以先把图像放大，然后用橡皮擦来擦掉这块区域，这样就变成背景区域了。
整个组织标记完之后图片是下面这样，标记为组织的是绿色，背景区域是灰色，点击Continue进入下一步。
第六步：文件导出
如下图，点击Export导出手动校准后的文件（后缀为.json），然后用于spaceranger管道中。
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