“单细胞”中研究APC/CCDH1失活调控细胞周期起始的分子机制
在单细胞测序高分文章满天飞的季节（有钱就是任性），对于辛辛苦苦做生物学实验的小伙伴来说有没有一些羡慕，嫉妒，恨呢。今天就和大家在这里分享一份福利，看大牛如何在单细胞水平玩转分子机制，做分子机制的同学们是否也想蹭蹭“单细胞”的热度了呢？这篇是2018年发表在Nature上的一篇关于细胞周期调控的文章。说起细胞周期大家一定再熟悉不过了，但是你真的很了解细胞周期吗？那就让我们来回顾一下吧。
哺乳动物细胞在G1期结束之前会决定是否进入和完成整个细胞周期活动。在细胞进入S期复制DNA之前，会**CDKs，进而启动E2F转录和APC/CCDH1（一个非常明星的E3泛素连接酶复合物）失活。最近发现一些应激条件可以逆转CDK2**和E2F诱导表达（R point，restriction point，之前认为是细胞进入细胞周期不可逆的关键事件），但是在APC/CCDH1失活后却无法逆转，提示APC/CCDH1的失活才是一个决定细胞进入细胞周期不可逆的关键事件，但是APC/CCDH1的失活和控制细胞周期这一关键步骤的分子机制不清。接下来就让我们看看这个问题是如何被解决的吧。
• 分子机制模型的预测和建立
Fig. 1 | EMI1 conveys hysteresis to APC/C CDH1 inactivation
由于APC/CCDH1失活在MCF10A细胞（做乳腺癌的小伙伴应该很熟悉，MCF10A是一种未转化的乳腺上皮细胞）中具有滞后的特点（什么是“滞后”后面再讲），而这种滞后也是决定细胞不可逆的进入细胞周期所需要的，所以选用这种细胞来建立实验体系。一般来讲，细胞信号传导中双稳态的调控模式是需要滞后现象的（图1.a的4号，APC/C活性的曲线斜率基本不变，水平向右移动，即滞后。如果没有2号Feedback调控，只有1号Trigger蛋白的调控作用，则不会有滞后的发生），同时根据实验室前期报道（可精读原文查找），以及APC/CCDH1失活具有非常快速的特点，根据这些线索预测了这个分子调控的模型（不得不说这是整篇文章的重中之重。整篇文章充斥着数学思想和自然科学思想，除了滞后模型，对于如何最快的调节一个分子，你调节我，我调节你这种相互调控被提出，有点类似于物理学中力的作用是相互的思想。哲学是所有科学的本质，而数学是自然科学的本质，这句名言确实非常耐人寻味啊！另外一点值得佩服的是上来就直接提出一种调控模型，这需要非常严谨的推理和极大的勇气，让人想起了沃森和克里克最早提出的DNA双螺旋模型，那也是没有任何实验证据，仅仅通过推理建模而已，但最终却获得了诺贝尔奖）。
Fig. 1 | EMI1 conveys hysteresis to APC/C CDH1 inactivation
接下来还是根据前期研究成果，确定了潜在的trigger蛋白和feedback蛋白。Trigger蛋白可能是CDK1/2，feedback蛋白可能是EMI1（先前报道是APC/CCDH1的inhibitor），且EMI1敲低后可以让滞后（图1.b）现象消失（图1.d）。这里我还要提的就是开头我们讲的“单细胞”啦。该课题组前期发明了一种live-cell reporter系统，这个系统可以在单细胞水平检测酶的活性，如图1.c所示，每条细线就是一个细胞，也是通过该技术完成了对feedback蛋白的初步筛选。
• 验证EMI1是APC/CCDH1在细胞G1期到S期转化过程中的一个底物
Fig. 2 | The APC/C CDH1 inhibitor EMI1 is also an APC/C CDH1 substrate that is degraded during G1 and builds up at the G1–S transition
首先检测EMI1蛋白在有丝分裂后6小时开始大量积累，这和APC/CCDH1失活的时间是相吻合的（图2.a）。后面通过APC的抑制剂进一步确认EMI1蛋白表达受到APC/CCDH1的调控。接着又分别分析了相关分子的mRNA（图2.c）和蛋白（图2.d）表达水平，发现EMI1和Geminin（APC/CCDH1的一个已知底物蛋白）的蛋白表达相对于mRNA表达有明显的滞后现象，而且EMI1和Geminin蛋白开始积累的时间正好是APC/CCDH1失活的时间点。最后通过体外泛素化实验证明EMI1是APC/CCDH1的一个底物（图2.e）。这一部分数据进一步验证APC/CCDH1和EMI1之间是否可以形成相互调节的loop。
• 确定APC/CCDH1失活是由双稳态的负反馈调节机制控制
Fig. 3 | APC/C CDH1 inactivation is a bistable switch driven by dual-negative feedback
Extended Data Fig. 6 | EMI1 and geminin protein levels are tightly correlated during the cell cycle
先前报道EMI1可以通过两个domain和APC/CCDH1两个不同regions结合，暗示EMI1可能通过这两种与APC/CCDH1的结合方式swtich其作为inhibitor还是底物的状态。图a中RXXL D-box motif是作为底物与APC/CCDH1结合的区域。而EMI1的ZBR可以结合APC2的C-terminal的LRRL序列（抑制与E2的结合）。接下来还是通过单细胞酶活检测系统进行分析，发现CDK4/6的inhibitor（例如Palbociclib，FDA已批准上市用于治疗肿瘤。至于为什么使用CDK4/6的inhibitor，而不用CDK1/2的inhibitor请看Extended Data Fig. 6.e）对于APC/CCDH1**作用被EMI1的WT和AXXA突变体抑制，而C401S突变体无法抑制APC/CCDH1**，说明EMI1抑制APC/CCDH1的活性是通过抑制其与E2的结合，而不是是否可作为APC/CCDH1的底物被招募（图3.b-e）。当EMI1不能结合APC/CCDH1的E2结合位点后，无法抑制APC/CCDH1的活性（Extended Data Fig. 6.c），即APC/CCDH1-on。当EMI1不能结合APC/CCDH1的底物结合位点时，更多的去结合APC/CCDH1的E2结合位点，这时就会表现抑制APC/CCDH1活性的作用（Extended Data Fig. 6.d），即APC/CCDH1-off。同理，CDK2的活性，EMI1的表达水平与APC/CCDH1活性的关系如图3.f所示。
• 进一步揭示CDK2，EMI1的mRNA合成和APC/CCDH1活性在细胞周期调控中的关系
Fig. 4 | Cyclin E–CDK2 activity and EMI1 mRNA synthesis synergistically trigger the EMI1–APC/C CDH1 inactivation switch and cell-cycle commitment
接下来要验证EMI1的浓度与APC/C CDH1活性间的关系，这是预测模型中第二个关键所在。如图4.a-c所示，EMI1的重组蛋白在低浓度时，很容易发生多聚泛素化，此时EMI1可随机结合APC/C CDH1的两个结合区域，所以APC/C CDH1具有较高的活性；而随着EMI1浓度的升高，EMI1的泛素化水平越来越低，此时APC/C CDH1的E2结合区域已经被EMI1完全结合，活性也就被抑制了。此外，研究还发现EMI1的mRNA水平足够高可以独立于CDK2的活性发挥抑制APC/C CDH1活性的功能（图4.d-f），而且细胞可以绕开细胞G1期cyclin E-CDK2的活性抑制APC/C CDH1活性（图4.g）。
Extended Data Fig. 10 | APC/C CDH1 inactivates before CDK2 activation in cells with cyclin E1 and cyclin E2 knocked down
此外，在U2OS细胞（E2F组成性**）中敲低EMI1完全阻止了APC/C CDH1的失活（Extended Data Fig. 10.c-d），提示CDK2活性独立于EMI1无法达到足够抑制APC/C CDH1活性的功能。细胞周期中APC/C CDH1-EMI1开关的整体调控模型如图4.h所示。
小结
该文章数据量庞大，给人一种大气磅礴之感，同时对于细节的把控也同样让人叹为观止。这篇文章初看有一定的难度，需要非常清楚细胞周期调控的研究进展，同时该文章的数学思想无处不在，需要细细推敲，读完给人一种想拍案而起的兴奋之感。该文章的开篇提出分子机制的模型时，两个字：惊艳，非常强的代入感让人自然而然的进入到故事中，想与作者一起验证模型的真伪，充分调动了读者的好奇心。再者就是对于哺乳动物细胞周期R point的完善，细胞不可逆的进入和完成细胞周期需要两步：Rb的失活和随后APC/C CDH1的失活，只有APC/C CDH1失活，细胞才会不可逆的进入细胞周期。另外就是开篇提到的“单细胞”技术，即本文中的一些实验方法也非常有借鉴意义，建议做蛋白泛素化修饰的同学们可以尝试尝试，总之希望大家各取所需。本文并没有什么所谓的套路，相反有一种特立独行之感，更多的在于给人思想上的启发，正所谓仁者见仁，智者见智。
好啦，本次文献分享就要结束了，希望大家能够喜欢。